4) 미생물의 분리 및 배양

실습목표

단일종의 미생물을 분리할 수 있다.

혼합 미생물에서 순수한 독립 집락을 분리, 배양할 수 있다.

평판 도말법으로 미생물 집락들의 모양과 색깔을 관찰할 수 있다.

실습 재료

비옥한 흙 1～2 g, 염화나트륨(NaCl), 육즙 평판 배지, 육즙 사면 배지, 유성 펜, 생리식염수(0.85 % NaCl용액)

기기/기구

백금이(loop), 시험관, 알코올램프, 무균 작업대, 배양기

관계 이론

백금이와 백금선

백금이(loop)와 백금선(needle)은 검사할 재료와 배양시킬 미생물을 배지에 옮겨 접종시키거나 도말할 때 사용된다. 이들은 백금으로 만들면 재질의 경도가 적당하고, 화염 멸균 후 냉각이 빠르며, 장기간 사용할 수 있어 좋으나 값이 비싸기 때문에 일상 검사용은 니크롬선으로 만든다.

백금선은 지름이 약 1 mm인 백금 또는 니크롬선을 길이가 5～7 cm되게 잘라 알루미늄 또는 스테인레스강으로 만든 자루에 끼운 것으로, 손잡이에는 플라스틱을 입혔다. 주로 천자 배양에 이용된다.

백금이는 백금선 끝을 지름 2～4 mm의 링(ring)으로 만든 것이며, 세균 또는 효모의 접종에 많이 쓰인다. 링부분에 채워진 균액의 중량이 2 mg이 되도록 링의 크기를 조절하여 만든 백금이를 표준 백금이라 한다. 그림에 백금이와 백금선을 나타내었다.

그림 백금이와 백금선

백금이와 백금선의 멸균

백금선이와 백금선은 사용 전과 사용 후에는 반드시 화염 멸균한다. 백금선과 백금이의 멸균법은 우선 니크롬선 부분이 붉은색을 띨 때까지 가열한 후, 백금선 전체의 거의 반정도까지 천천히 화염에 통과시킨다. 이 때, 백금선과 백금이를 산화염에 넣지 말고 우선 환원염에 넣었다가 서서히 산화염으로 옮겨 멸균하는 것이 바람직하다.

그림  백금이의 멸균법

온도가 높은 산화염으로 급히 가열하면 균이 튀어 나와 감염될 우려가 있기 때문이다. 이를 방지하기 위해 미리 5 % 페놀(phenol) 용액에 담그어 두었다가 화염으로 통과시키는 경우도 있다. 그림에 백금이의 화염 멸균법을 나타내었다.

화염으로는 분젠 버너(Bunsen burner) 불꽃, 알코올램프 불꽃, 전기 불꽃을 이용한다.

무균 조작

불꽃을 이용한 무균 조작

청결한 실습실 안의 공기 중에는 미생물의 수가 별로 많지 않으므로, 높은 무균 상태를 필요로 하지 않을 때에는 불꽃 가까운 곳에서 무균조작을 할 수도 있다.

미생물을 이식하거나 접종할 때, 솜마개를 뺀 시험관이나 플라스크의 입구를 수평으로 하여 불꽃에 가까이 대어 멸균하는데, 재빨리 조작하도록 한다. 이 때, 실습실 창문을 모두 닫아 될 수 있는 대로 공기의 유통이 일어나지 않도록 한다.

무균 작업대를 이용한 무균 조작

미생물의 분리, 이식 및 접종을 할 때 잡균의 오염을 막기 위하여 무균 작업대를 이용한다. 이는 무균 상태의 공기흐름을 만들어 순환시킴으로써, 외부 공기로 부터의 오염을 방지할 수 있다.

그림 무균 작업대

미생물의 순수 분리

미생물은 환경에 적응하는 능력이 매우 강해서 인체, 동물 및 자연계에 널리 퍼져 있다. 이러한 미생물들은 한 장소에 한 종류만 있는 것이 아니라, 여러 종류의 미생물이 서로 섞여 있다. 이들 미생물이 혼합되어 있는 시료에서 원하는 미생물을 골라내는 것을 순수 분리라 한다.

순수 분리의 원리는 여러 종류의 미생물이 섞여 있는 시료를 점차적으로 희석해 가며 배양함으로써, 결국에는 시료 속에 있는 한 마리의 미생물이 배지 위에서 증식하여 같은 종류의 미생물만으로 이루어진 집락(colony)을 만들도록 하여 분리하는 것이다.

미생물의 순수 분리 방법에는 평판 도말 배양법(streak plate culture)과 혼합 분주 배양법(pour plate culture)이 있다.

평판 도말 배양법

여러 종류의 미생물이 섞여 있는 시료 용액을 백금이에 묻힌 다음, 평판 배지의 한쪽에 접종하고 한쪽에 골고루 발라 1차 도말한다. 백금이를 화염 멸균한 후 1차 도말 부위를 2～3회 지나가게 하면서 2차 도말한다. 이 때 2차 도말 부위는 1차 도말 부위보다 미생물의 수가 감소하게 된다. 마찬가지로 3차, 4차 도말을 하면 미생물의 수는 4차 도말 부위에서는 월등히 감소하게 된다.

그 결과 1차 도말 부위에서는 미생물의 수가 많아 독립된 집락이 생기지 않지만, 3～4차 도말 부위에서는 미생물 수가 적어 독립된 집락이 생긴다.

혼합 분주 배양법

물, 우유, 소변 등의 가검물을 적당히 희석하여 희석액을 0.1～1 mL씩 각각 페트리 접시에 옮기고 45℃로 보온 유지한 멸균된 배지를 부어 혼합시켜 수평이 되도록 굳힌 다음 1～2일 배양하여 평판 배지 표면과 배지 속에서 자란 집락수 (개/mL)를 산정한다.

이 방법은 균의 분리에는 적당하지 않지만 균수 측정에는 흔히 이용된다.

주의사항

무균 작업대의 자외선 살균등은 실습하기 전에 30～60분 동안 켜 두었다가, 실습할 때에는 반드시 끈다.

사면 배지의 솜마개를 열고 알코올램프로 멸균을 할 때, 화상을 입지 않도록 조심한다.

미생물이 묻어 있는 백금이는 반드시 불꽃으로 멸균하여 둔다.

실습에 사용한 미생물은 고압 멸균하여 버리도록 한다.

미생물에 감염되지 않도록 미생물이 손에 묻거나 배양액을 흘렸을 때에는 소독액(70% 에틸알코올 등)으로 깨끗이 씻는다.

실습순서

평판 도말에 의한 미생물의 순수 분리

시험관에 10 mL의 생리 식염수(0.85 % NaCl용액)를 넣는다.

여기에 비혹한 흙 1 g을 넣고 잘 흔든 다음, 상층액을 시료로 사용한다.

무균 작업대 속에서 불꽃으로 멸균한 백금이로 시료를 한 번 묻힌 다음, 평판 배지의 한쪽 끝 부분에만 1차 도말한다.

백금이를 다시 불꽃으로 멸균하고 완전히 식힌 다음, 평판 배지를 90°로 돌린 후 1차 도말한 끝 부분에서 두세 번 겹치도록 하여 2차 도말한다.

4) 같은 방법으로 도말이 안 된 배지의 부분에 한두 번 더 도말하여 3～4차 도말이 되도록 한다.

도말이 끝난 평판 배지는 뚜껑을 덮어 뒤집어서 배양기에 넣어 37℃에서 1～2일 배양한다.

배양이 끝난 다음, 배지에 나타난 미생물 집락들이 하나씩 떨어져 있는가를 모양과 색깔을 비교하면서 관찰한다.

그림 미생물의 평판 도말법

미생물의 배양

순수 분리한 미생물의 배양 과정은 그림과 같다.

순수 분리한 미생물의 집락 가운데에서 모양과 색깔이 균일한 집락을 하나 골라 시료균으로 한다.

오른손에 백금이를 잡고 알코올램프 불꽃에 니크롬선이 빨갛게 될 때까지 가열하고, 자루의 금속 부분도 불꽃 속을 2～3회 재빨리 통과시킨다.

평판 배지의 뚜껑을 한쪽만 조금 열고 미생물의 집락이 없는 깨끗한 부분의 배지에 가열된 백금이를 살짝 찔러 충분히 식힌 다음, 시료군으로 하는 집락에 백금이를 접촉시켜 미생물이 묻도록 한다.

사면 배지 시험관의 밑 부분을 왼손으로 잡고, 알코올램프의 불꽃 가까이에서 오른손 새끼손가락으로 솜마개를 살짝 돌리면서 뺀 후 시험관의 입구를 불꽃에 2～3회 통과시켜 멸균한다. 이 때, 백금이는 오른손에 쥔 상태로 솜마개를 빼야 하며, 백금이 또는 솜마개를 떨어뜨리거나 실습대 위에 놓아서는 안된다.

시료균이 묻어 있는 백금이를 재빨리 시험관 속에 넣어 사면 배지의 표면 밑 부분에 가볍게 접촉시키고, 지그재그선을 그으면서 표면 전체에 접종한다. (천자 배양)

접종이 끝난 다음 시험관의 입구를 불꽃 속으로 2～3회 통과시키고 솜마개로 막는다. 백금이는 불꽃에서 빨갛게 될 때까지 가열하여, 묻어 있는 미생물을 완전히 태워버린 다음 실습대 위에 놓는다.

위 시험관을 37℃의 배양기에 넣어 1～2일 배양한 다음, 미생물의 생육 상태 및 다른 종류의 미생물이 혼합되지 않는가를 관찰한다.

그림 순수 분리한 미생물의 사면배지 접종 과정