4) 미생물의 배지 제조

실습목표

배지의 역할과 종류에 대해 설명할 수 있다.

미생물의 종류에 따라 배양에 필요한 배지를 선택할 수 있다.

각종 배지를 만들어낼 수 있다.

실습 재료

솜(탈지하지 않은 것), 쇠고기 추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 염화나트륨(NaCl), 한천(agar), 염산(1 N-HCl), 수산화나트륨(1 N-NaOH), 알루미늄 호일(aluminum foil)

기기/기구

피펫, 시험관, 페트리 접시, 2 L 용 삼각 플라스크, 항온수조, 건열 멸균기, 고압 증기멸균기, 중탕냄비, 냉장고, 알코올램프, pH 미터

관계 이론

솜마개

멸균한 배지 또는 미생물이 들어 있는 시험관이나 삼각 플라스크의 입구는, 공기 중에 떠도는 미생물로부터의 오염을 막기 위해 솜마개를 한다. 솜마개는 미생물이 자라는데 필요한 공기와 수분은 자유로이 통과시키나, 그 외의 미생물, 미생물 포자 및 먼지와 같은 작은 물질은 통과시키지 않는 여과기의 역할을 한다.

각종 시험관 마개

탈지한 솜은 물을 잘 흡수하여 쉽게 젖은 상태로 되어 오염의 원인이 될 수 있으며, 공기의 유통도 좋지 않으므로 탈지하지 않은 솜을 사용하여야 한다.

근래에는 솜마개 외에 나선형 플라스틱 뚜껑, 금속제(알루미늄) 뚜껑 및 실리콘 마개 등도 사용되고 있다. 그림은 널리 사용되고 있는 시험관 마개를 나타내었다.

배지

미생물이 자라고 증식하는데 필요한 여러가지 영양분이 들어 있는 혼합물을 배지라 하며, 배지를 사용하여 미생물을 키우는 것을 배양이라 한다.

배지의 성분은 미생물의 종류 및 배양 목적에 따라 각각 다르지만 기본적으로 배지의 성분은 탄소원, 질소원, 무기 염류, 아미노산 및 성장인자로 이루어져 있다. 이들 성분의 농도 및 배지의 수소 이온 농도(pH)도 미생물이 자라는데 영향을 미치므로, 필요에 따라 조절해야 한다.

배지는 만드는 재료 및 배지의 물리적 상태에 따라 다음과 같이 나눌 수 있다.

재료에 따른 배지의 종류

천연 배지 : 여러가지 성분이 복합적으로 포함된 천연물을 재료로 사용한 배지이다. 재료로는 육즙, 펩톤, 효모 추출액, 엿기름즙 등이 많이 쓰이며, 미생물이 빨리 잘 자라는 반면, 배지의 정확한 화학적 성분은 알 수 없다. 일반적으로 미생물의 단순한 배양이나 미생물의 보존에 많이 쓰인다.

합성배지

합성 배지 : 화학적 조성을 정확하게 알 수 있는 물질(예 : 탄소원으로 글루코스, 질소원으로 암모늄염 등)을 재료로 사용한 배지이다. 일반적으로 세균의 생화학적 성상검사, 균체 성분, 세균의 대사 연구 등에 많이 쓰인다.

물리적 상태에 따른 배지의 종류

액체 배지 : 한천이나 젤라틴 같은 고형화 물질을 넣지 않은 액체 상태의 배지로, 미생물의 대량 배양, 당분해 시험 및 미생물이 생산하는 각종 유용 물질의 검출과 연구에 많이 사용된다.

고체 배지 : 액체 배지에 한천 또는 젤라틴을 1.5 %정도 섞어 고형화한 것과 밀기울, 찐쌀과 같이 재료 자체가 고체인 것이 있다. 주로 미생물의 분리, 보존, 형태 관찰 및 고체 배양에 사용된다. 일반적으로 한천이 가장 많이 사용되며, 실습목적에 따라 그림과 같이 사면 배지, 고층 배지, 반사면 배지, 그리고 평판 배지로 만들 수 있다. 사면 배지는 시험관에 배지가 약 45°경사가 되도록 굳힌 것으로 호기성 미생물의 배양 및 보존에 많이 쓰인다. 만들 때 배지의 양이 너무 많거나 너무 비스듬히 놓아서 배지가 시험관의 입구 가까이 가면 오염의 원인이 될 수 있으므로 주의한다. 보통 시험관 길이의 [eqn: 1 over 3 ～ 1 over 2]이 되도록 하는 것이 적당하다. 고층 배지는 시험관을 세운 채로 배지를 굳힌 것으로, 혐기성 미생물의 배양 및 보존에 많이 쓰인다. 반사면 배지는 고층 배지의 윗부분 [eqn: 1 over 3]정도를 경사지게 만든 것으로 세균의 생물학적 성상 검사, 당분해 검사에 많이 쓰인다. 평판 배지는 페트리 접시에 두께가 4 mm 정도 되게 배지를 넣어 굳힌 것으로 미생물의 순수 분리 및 형태 관찰에 많이 쓰인다. 이는 표면에 물기가 남아 있으면 배양 중에 미생물이 흘러 배지 표면 전체에 퍼지므로, 미생물을 분리할 수 없을 뿐 아니라 집락을 형성시킬 수가 없다. 이 배지는 솜마개를 한 시험관의 배지에 비하여 쉽게 오염이 되므로 실습하기 1～2 일 전에 만들어 쓰는 것이 좋다.

고체 배지의 종류

주의사항

미생물에 의한 오염을 방지하기 위하여 실습실과 실습대 및 실습 도구를 항상 청결히 한다.

미생물이 손에 묻거나 배양액을 흘렸을 때에는 반드시 소독액(70 % 에틸알코올 용액 등)으로 씻어 내고, 실습이 끝난 후에도 비누 또는 소독액으로 손을 씻는다.

실습에 사용한 미생물 및 배지는 반드시 멸균하여 버리도록 하며, 특히 한천 배지는 멸균한 다음 뜨거운 물로 희석하여 버림으로써 하수구가 막히는 일이 없도록 한다.

고압 증기멸균기, 건열 멸균기, 배양기 등 실습 기구는 올바르게 사용하여 화재, 폭발 등의 사고를 미연에 방지하도록 한다.

배지가 녹을 때 거품이 일어 넘칠 수가 있으므로 제조 용량보다 2 배 이상 큰 플라스크를 사용하여 녹인다.

실습순서

솜마개 만들기

솜마개를 하려고 하는 시험관 입구의 크기에 따라 솜을 적당한 크기의 사각형으로 자른다. 보통 크기의 시험관(15 mm×170 mm)인 경우 솜의 두께 1～2 cm, 길이 8～10 cm가 적당하다.

사각형 솜의 가장자리를 조금씩 뜯어 가운데로 모아서 지름 2 cm 정도의 단단한 심을 만든다.

왼손으로 시험관의 입구를 잡고 오른손의 솜 끝 부분이 둥글게 되도록 하면서 시험관에 넣어, 시계 방향으로 가볍게 돌리면서 밀어 넣는다. 보통 크기의 시험관인 경우 안쪽으로 3～5 cm, 바깥쪽으로 1.5～2 cm 나오게 한다. 플라스크의 경우는 안쪽으로 3～5 cm, 바깥쪽으로 2～3 cm 나오게 한다.

잘 만들어진 솜마개를 시험관에 끼운 채 건열 멸균기에 넣어 160℃에서 30 분간 건열 멸균한다. 솜마개가 너무 단단하거나 헐거워도 좋지 않으며, 안쪽에 들어간 부분의 솜 층이 고르지 않거나 주름이 있으면 오염의 원인이 될 수 있다. 건열 멸균한 다음에는 솜마개의 모양이 고정되어, 솜마개를 빼도 흐트러지지 않는다.

배지 만들기

사면 배지

솜마개를 끼운 시험관을 준비한다.

증류수 1 L에 쇠고기 추출물 3 g, 펩톤 5 g, 한천 15 g, 염화나트륨 5 g 의 비율로 삼각 플라스크에 넣는다. 이 때, 배지를 만들 양의 반정도의 증류수를 먼저 삼각 플라스크에 넣고 위 조성에 따라 필요한 내용물을 신속히 저울로 달아 넣어준 후, 나머지 양의 증류수로 기벽에 묻은 내용물을 씻어내는 식으로 플라스크에 넣는다.

플라스크를 잘 흔들어 분말이 완전히 풀어지면, 끓는 물로 중탕 가열하여 내용물을 완전히 녹인다. 이 때, 가열하는 동안 유리봉으로 계속하여 저어준다.

위의 용액을 50～60℃로 식혀 pH를 측정하여 1 N-HCl이나 1 N-NaOH로 pH를 조절하여 6.8 로 한다.

물중탕하여 녹인 배지를 시험관에 7～10 mL씩 나누어 넣는다. 시험관에 넣을 때, 배지가 시험관의 입구 또는 솜마개에 묻으면 나중에 오염의 원인이 될 수 있으므로 주의하여 넣는다.

배지를 넣고 솜마개를 한 다음, 솜마개의 겉을 알루미늄박으로 싸고, 고압 증기멸균기로 121℃(1.05  kg/cm2)에서 15분간 멸균한다.

멸균이 끝나고 고압 증기멸균기의 측정 압력이 완전히 0 이 된 것을 확인한 다음 꺼내어, 한천이 굳기 전에 유리 막대나 나무 막대로 시험관을 받쳐 비스듬히 놓아 응고시킨다.

한천 평판배지의 제조 방법

평판 배지

건열 멸균기를 사용하여 160℃에서 30～60분간 멸균한 페트리 접시를 준비한다.

1)의 나),다),라)의 요령으로 배지 성분을 완전히 녹이고, pH를 6.8로 조절한다.

알루미늄 호일이나 거즈뭉치로 삼각 플라스크의 뚜껑을 막고 고압 증기멸균기로 121℃(1.05  kg/cm2)에서 15 분간 멸균한다.

삼각 플라스크 채로 멸균한 배지를 항온수조에 넣어 50～55℃ 정도로 식힌다.

멸균한 배지를 페트리 접시의 뚜껑을 한쪽만 조금 열고 붓는다. 페트리 접시에 붓는 배지의 양은 15～20 mL가 적당하다.

배지를 부은 페트리 접시는 즉시 뚜껑을 덮고 배지가 굳을 때까지 그대로 둔다.

배지의 표면이 어느 정도 건조된 다음 가능한 한 빨리 실습에 사용하거나, 한천이 완전히 응고된 페트리 접시는 오염을 방지하기 위하여 뒤집은 상태로 4℃ 냉장고에 보관한다.기구 세척 및 멸균을 위한 준비